砷污染是全球性的健康問(wèn)題，全世界大約有1.4億人口的飲用水不能滿足WHO規(guī)定的飲用水安全限（10 ppb）。長(zhǎng)期飲用砷含量超標(biāo)的飲用水將引起一系列的健康問(wèn)題，甚至癌癥病變。因此，美國(guó)的有毒物質(zhì)和疾病登記署（ATSDR）多年來(lái)一直將砷排在危險(xiǎn)物質(zhì)名單的前列。為準(zhǔn)確評(píng)估砷污染水平，使人類免受高砷環(huán)境的毒害，亟需開(kāi)發(fā)高靈敏、快速，可靠的方法用于砷污染分析。

相比傳統(tǒng)的高端分析方法用于砷檢測(cè)，全細(xì)胞生物傳感器（Whole-CellBiosensor）由于具有低花費(fèi)、便攜、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)而受到青睞。然而基于天然砷調(diào)控系統(tǒng)（ArsR/Pars）的全細(xì)胞生物傳感器通常存在高泄露表達(dá)、低誘導(dǎo)倍數(shù)等問(wèn)題，導(dǎo)致傳感器的背景噪音和信噪比不能滿足應(yīng)用需求。這主要是由于ArsR轉(zhuǎn)錄因子不能嚴(yán)格控制Pars啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)-轉(zhuǎn)錄調(diào)控作為砷傳感系統(tǒng)的唯一控制器，選擇嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的Pars啟動(dòng)子對(duì)于開(kāi)發(fā)高靈敏的全細(xì)胞砷傳感器至關(guān)重要。盡管之前的研究通過(guò)啟動(dòng)子工程，信號(hào)放大和翻譯后調(diào)控等策略可以有效改善傳感器的信噪比。

然而，那均需要額外添加ArsR結(jié)合位點(diǎn)（ABS）來(lái)降低傳感器的泄露，其結(jié)果也表明ABS的添加不利于傳感器的信號(hào)輸出和靈敏度。因而需要對(duì)砷調(diào)控啟動(dòng)子Pars進(jìn)行從頭設(shè)計(jì)，然而，由于其ABS長(zhǎng)達(dá)33 bp很難通過(guò)傳統(tǒng)的方法將其自由的嵌入啟動(dòng)子不同位置。

近日，石河子大學(xué)葉邦策教授和浙江大學(xué)王寶俊教授作為共同通訊作者（石河子大學(xué)博士生陳升言為第一作者）在Analytical Chemistry雜志合作發(fā)表了題為“De Novo Design of the ArsR Regulated Pars Promoter Enables a Highly Sensitive Whole-Cell Biosensor for Arsenic Contamination”的文章。



圖1 高靈敏熒光傳感器的開(kāi)發(fā)及比色傳感陣列的快速分析

該研究將來(lái)源于Escherichia coliMG1655的砷響應(yīng)系統(tǒng)（ArsR/Pars）作為感應(yīng)元件，并分別耦合gfp和lacZ為報(bào)告基因用于重構(gòu)啟動(dòng)子的表征。為了能有效的降低傳感器的泄露表達(dá)并不損失傳感器的信號(hào)輸出和靈敏度，該研究將長(zhǎng)達(dá)33bp的ABS序列與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（即-10和-35位點(diǎn)）序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，挖掘了ABS序列內(nèi)潛在的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)分析、設(shè)計(jì)和優(yōu)化，獲得了不同結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子模型。并通過(guò)將ABS序列最大程度的嵌入啟動(dòng)子核心區(qū)（即-10和-35位點(diǎn)之間，約17 bp），獲得了最大抑制效率和最高誘導(dǎo)倍數(shù)的新啟動(dòng)子ParsOC2，實(shí)現(xiàn)了泄露表達(dá)和信號(hào)輸出的同時(shí)改善?；谠搯?dòng)子開(kāi)發(fā)的熒光傳感器PlacV-ParsOC2在高于9.38 pp砷濃度時(shí)，展現(xiàn)出裸眼可見(jiàn)的綠色熒光；在300 ppb砷濃度時(shí)，誘導(dǎo)倍數(shù)提高至183.52倍；檢測(cè)限低至0.24 ppb，比WHO規(guī)定的飲用水安全水平10 ppb低了41.67倍。



圖2 不同砷響應(yīng)啟動(dòng)子構(gòu)成的熒光傳感器的表征

為了快速診斷砷濃度是否超過(guò)安全水平限值，該研究使用lacZ取代了gfp作為報(bào)告基因（其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶能催化無(wú)色底物X-Gal顯藍(lán)色）以產(chǎn)生肉眼可區(qū)分的信號(hào)輸出。并驗(yàn)證了重構(gòu)的啟動(dòng)子ParsOC2相比野生型啟動(dòng)子ParsOWT擁有更低的背景和更靈敏的顏色反應(yīng)。最優(yōu)的比色傳感器PlacV-ParsOC2-lacZ在0-5 ppb范圍內(nèi)呈良好的線性，R2= 0.9928；檢測(cè)限低至0.39 ppb，比WHO規(guī)定的飲用水安全水平10 ppb低了25.64倍。

基于最優(yōu)的比色傳感器制備了比色傳感陣列，并將其耦合智能手機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)便攜設(shè)備對(duì)地下水砷樣品的快速分析。通過(guò)智能手機(jī)拍照對(duì)不同稀釋因子下的地下水砷樣品的顏色反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行快速記錄，并通過(guò)顏色識(shí)別軟件，對(duì)比色陣列中的每一個(gè)顏色結(jié)果進(jìn)行分析，以實(shí)現(xiàn)對(duì)砷污染狀況的快速評(píng)估。最終，該傳感器的評(píng)估結(jié)果與樣品的實(shí)際濃度保持良好的一致性，回收率在86.08-94.26%之間。



圖3 比色法耦合智能手機(jī)分析用于砷的測(cè)定

綜上所述，為解決砷響應(yīng)全細(xì)胞傳感器的高泄露和低誘導(dǎo)倍數(shù)等問(wèn)題，針對(duì)帶有長(zhǎng)足跡位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的啟動(dòng)子，該研究提出了新的啟動(dòng)子從頭設(shè)計(jì)方法。相比易錯(cuò)PCR和高通量篩選等方法，該方法簡(jiǎn)便有效；同時(shí)不需要額外的遺傳組分即可降低泄露和增加信號(hào)輸出，為其它啟動(dòng)子的從頭設(shè)計(jì)和傳感器的開(kāi)發(fā)提供了重要參考。該方法通過(guò)改變啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)配置，從根本上提高了ArsR對(duì)Pars啟動(dòng)子的阻遏效率，避免了通過(guò)使用過(guò)量的ArsR和額外添加ABS來(lái)降低傳感器的泄露。因此，該方法可以在有效降低泄露表達(dá)和增加誘導(dǎo)倍數(shù)的同時(shí)，而不影響傳感器的靈敏度和信號(hào)輸出。該研究通過(guò)耦合智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)比色結(jié)果的快速分析，將促進(jìn)全細(xì)胞傳感器的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用及砷污染的快速評(píng)估。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00055

審核編輯：劉清