圖 1：Coherent Axon 780 飛秒激光器

Becker & Hickl GmbH 是光子計數(shù)設備的技術領導者，早些時候已經(jīng)表明，小型飛秒光纖激光器可用作多光子熒光成像系統(tǒng)的廉價激發(fā)源。激光器的發(fā)射波長為 780 nm，脈沖頻率為 40 MHz 至 80 MHz，平均功率為 100 mW 至 500 mW，不僅適用于激發(fā) NAD(P)H，還適用于各種其他熒光團，包括熒光壽命極短的熒光團。

因此，Becker & Hickl 有興趣了解 Axon 飛秒光纖激光器在這些應用中的性能。

“我們已經(jīng)證明，相干公司 Axon 780 飛秒光纖激光器與 bh 的精確掃描儀光學元件器件、探測器、TCSPC / FLIM 電子器件和數(shù)據(jù)分析軟件相結(jié)合，可提供有關活細胞和組織代謝的準確信息?！报C Wolfgang Becker，德國柏林 Becker & Hickl GmbH 總經(jīng)理

系統(tǒng)架構(gòu)

作為測試系統(tǒng)，他們使用 bh DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統(tǒng)。該系統(tǒng)的架構(gòu)如圖 2 所示。

圖 2：多光子激光掃描 FLIM 系統(tǒng)原理

Axon 780 激光器的激光器激光束通過自由光束注入 DCS-120 掃描頭。在掃描頭內(nèi)部，它被兩個快速振鏡偏轉(zhuǎn)。掃描頭的掃描透鏡將激光束投射到顯微鏡中。在顯微鏡內(nèi)部，光束穿過二向色分束器，并投影到顯微鏡透鏡的后孔上。顯微鏡物透鏡將光束聚焦到樣品內(nèi)部的圖像平面中。當光束被振鏡偏轉(zhuǎn)時，激光激光器聚焦光柵掃描會在樣品中的圖像區(qū)域上方進行。

為了獲得最大的空間分辨率，激光束必須完全填充顯微鏡透鏡的后孔徑。對于掃描和管透鏡的通常焦距，情況并非自動發(fā)生。因此，光束在進入掃描儀之前會擴展 1.5 倍。后孔中的光束直徑約為 12 mm，這足以填充即使是最大的顯微鏡透鏡的孔徑。過度填充微孔是沒有問題的。激發(fā)功率的相關損失是可以容忍的，因為激光器提供的功率遠遠超過所需的功率。

從樣品中收集熒光，通過顯微鏡透鏡返回，然后通過非去掃描光束路徑饋送。L1 和 L2 形成望遠鏡。望遠鏡還收集顯微鏡透鏡未完全準直的光子，例如散射在厚樣品之外的光子。熒光被分成兩個波長間隔，并通過兩個 bh HPM-100-40 混合檢測器進行檢測。檢測器的單光子脈沖記錄在兩個 SPC-180N TCSPC / FLIM 模塊中。SPC-180N 模塊確定激發(fā)脈沖后光子的檢測時間和掃描儀在光子檢測時的位置。此信息用于構(gòu)建 FLIM 圖像。這些是像素陣列，每個像素在大量時間通道中都包含完整的熒光衰減曲線。

反激相位激光束和光束消隱的掃描由 bh GVD-140 掃描控制器卡進行硬件控制。激光強度控制通過 Axon 激光器的 AOM 控制信號輸入執(zhí)行。該信號也由 GVD-140 卡提供。整個系統(tǒng)由 bh 的 SPCM 數(shù)據(jù)采集和控制軟件運行，提供具有掃描儀控制、激光器控制、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析功能的完全集成 FLIM 系統(tǒng)。FLIM 系統(tǒng)的用戶界面如圖 3 所示。

圖 3：SPCM 數(shù)據(jù)采集和控制軟件的主面板

結(jié)果

使用 DCS-120-AXON 組合拍攝的 FLIM 圖像如圖 4 至圖 6 所示。所有圖像均使用 40x，NA= 1.3 的油浸透鏡。使用 bh SPCImage NG FLIM 數(shù)據(jù)分析套件進行數(shù)據(jù)分析。圖 4 和圖 5 顯示了平均(振幅加權(quán))壽命和代謝指標 a1 的顏色編碼 FLIM 圖像。右上方顯示了所選圖像參數(shù)(tm 或 a1)的直方圖，右下方顯示了光標位置的衰減曲線。所選光斑的衰減參數(shù)顯示得非常右。

圖 4：豬皮、NADH 圖像、雙指數(shù)衰減的振幅加權(quán)平均壽命

圖 5：豬皮、NADH 圖像、振幅、a1、快速衰變成分。a1 是代謝狀態(tài)的指標

圖 6 顯示了酵母細胞。選擇發(fā)射濾光片來檢測 440 至 470 nm，從而將光譜范圍限制為檢測 NAD(P)H。 470 nm 的檢測上限可能看起來非常嚴格。但是，為了避免檢測 FAD 和 FMN 熒光，必須限制在 470 nm 以下。這些化合物與 NAD(P)H 一起被激發(fā)，但對代謝狀態(tài)表現(xiàn)出不同的依賴性。數(shù)據(jù)通過 SPCImage NG 的 MLE 算法進行分析，在圖像的各個像素中提供高精度雙指數(shù)衰減參數(shù)。所示圖像顯示 a1，即快速衰減分量的振幅。它表示未結(jié)合 NAD(P)H 的數(shù)量。 由于結(jié)合/游離比隨代謝而變化，a1 也稱為“代謝指標”。

可以看出，a1 在不同細胞中明顯不同。這表明不同細胞中的代謝狀態(tài)不同。高 a1(顯示為藍色)表示新陳代謝更糖酵解，低 a1(黃色)表示更氧化。

圖 6：酵母細胞、NADH 圖像、振幅、a1、快速衰變組分、代謝狀態(tài)指標

“我們已經(jīng)證明，相干公司 Axon 780 飛秒光纖激光器與 bh 的精確掃描儀光學元件器件、探測器、TCSPC / FLIM 電子器件和數(shù)據(jù)分析軟件相結(jié)合，可提供有關活細胞和組織代謝的準確信息。” 憑借其基于 AOM 的內(nèi)部強度控制，激光器可以順利集成到 bh 的 SPCM FLIM 采集軟件中。在光束停止情況和掃描儀反激階段以及可重現(xiàn)的強度控制下，光束消隱可保護樣品免受局部光損傷。總而言之，DCS-120 MP / Axon 780 組合是一種易于使用的高分辨率、高靈敏度雙光子激光掃描 FLIM 顯微鏡。


審核編輯 黃宇