熒光輔助的數(shù)字計(jì)數(shù)分析技術(shù)是指利用倒置熒光顯微鏡，可視化量化熒光探針數(shù)量，用于靶標(biāo)定量檢測的一類技術(shù)。目前，已有包括有機(jī)染料、量子點(diǎn)、納米顆粒、微珠、DNA納米結(jié)構(gòu)等多種熒光標(biāo)記探針被報(bào)道。然而，這些探針普遍存在亮度低、尺寸小、制備工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中易導(dǎo)致檢測靈敏度低、成像設(shè)備要求高及重復(fù)性差等不足。工程化腫瘤細(xì)胞作為一種新型生物工具，現(xiàn)已成功應(yīng)用于腫瘤治療、納米藥物遞送和納米材料合成等領(lǐng)域，這些工作為構(gòu)筑熒光單細(xì)胞探針提供有利理論依據(jù)。

近期，廣西師范大學(xué)張亮亮、胡盛強(qiáng)課題組與安陽師范學(xué)院高鳳麗課題組合作提出使用功能化磁性納米顆粒來定性修飾熒光染色的腫瘤細(xì)胞，用于構(gòu)筑磁性熒光單細(xì)胞探針。結(jié)合熒光輔助的數(shù)字計(jì)數(shù)策略，量化靶標(biāo)依賴的結(jié)合或剪切事件，以期實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)靈敏、快速分析。相關(guān)成果以“Engineered Cancer Cells as Signal Probes for Fluorescence-Assisted DigitalCounting Analysis”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威期刊Analytical Chemistry上。

在該項(xiàng)研究中，研究人員首先選擇適配體功能化的磁性納米粒子與熒光染色的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，初步嘗試磁性熒光單細(xì)胞探針構(gòu)筑的可能性。細(xì)胞成像結(jié)果表明，微米級腫瘤細(xì)胞表面明顯覆蓋一層磁性納米粒子涂層，且細(xì)胞形貌保持不變，該結(jié)果有利證明熒光單細(xì)胞探針的成功構(gòu)筑。不同于適配體與細(xì)胞膜蛋白特異性相互作用，基于細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的非選擇性親疏水作用也可為磁性熒光單細(xì)胞探針構(gòu)筑提供另一種可能。除細(xì)胞膜表面天然受體外，選擇合適的化學(xué)修飾策略，在細(xì)胞表面引入人工受體，也可以用于構(gòu)筑熒光單細(xì)胞探針。

圖1：（a）Fe?O? NPs的TEM圖；（b）Ramos細(xì)胞共聚焦圖；（c）熒光單細(xì)胞探針構(gòu)筑示意圖；（d）明場、（e）Hoechst33342通道及（f）疊場單細(xì)胞探針熒光成像圖



圖2：（a）熒光單細(xì)胞探針的不同構(gòu)筑策略；（b）同時(shí)構(gòu)筑Fe?O?-Ramos和Fe?O?-CCRF-CEM熒光單細(xì)胞

隨后，研究人員利用所構(gòu)筑的熒光單細(xì)胞探針構(gòu)建熒光輔助的數(shù)碼計(jì)數(shù)平臺。作為概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，研究人員通過合理設(shè)計(jì)適配體序列，引入核酸外切酶III（Exo III）識別位點(diǎn)。通過可視化計(jì)算Exo III加入前后熒光單細(xì)胞探針數(shù)量，來量化靶標(biāo)依賴的剪切事件，從而實(shí)現(xiàn)Exo III活性的間接數(shù)字檢測。此外，基于適配體的特異性識別與連接作用，研究人員選擇適配體功能化的磁性納米粒子來直接檢測腫瘤細(xì)胞。

圖3：（a）Exo III活性數(shù)碼計(jì)數(shù)分析示意圖；（b）瓊脂糖凝膠電泳圖；（c）不同濃度Exo III下Fe?O?-Ramos單細(xì)胞探針的共聚焦熒光顯微鏡圖像；（d）Fe?O?-Ramos單細(xì)胞探針數(shù)量與ExoIII濃度的關(guān)系曲線；（e）選擇性實(shí)驗(yàn)圖

綜上所述，該研究開發(fā)了一種新穎的熒光輔助數(shù)字計(jì)數(shù)策略，用于高靈敏、選擇性分析。相較于傳統(tǒng)的熒光探針，熒光單細(xì)胞探針在數(shù)字計(jì)數(shù)分析方面具有以下優(yōu)勢：（1）明亮的熒光和大尺寸能夠?qū)γ總€(gè)靶標(biāo)結(jié)合事件做出高保真的響應(yīng)；（2）多種細(xì)胞工程方法為合理設(shè)計(jì)單細(xì)胞探針提供了多種選擇；（3）可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的直接定量檢測；（4）具有多種靶標(biāo)同時(shí)數(shù)字計(jì)數(shù)分析的潛力。

審核編輯：劉清